CHO細胞DNA殘留定量檢測試劑盒說明書
貨號：71021
CHO 殘留 DNA 檢測試劑盒是用于定量檢測各種生物制品及藥品的中間品、半成品和成品中殘留的 CHO 宿主細胞DNA，試劑盒采用熒光探針原理，定量檢測樣本中 CHO 殘留DNA。具有檢測快速，專一性強，性能可靠，最低檢測限可以達到 fg 級別等特點。試劑盒內含 CHO DNA 定量參考品，已溯源至國家標準品。
| 組份 |
裝量 |
數量 |
儲存條件 |
| CHO DNA 定量參考品 |
15ng/瓶 |
1瓶 |
2-8℃及以下 |
CHO細胞熒光定量PCR試劑
（含ROX校正染料） |
680uL/瓶 |
3瓶 |
-20℃，避光 |
| 復溶液 |
1.5ml/瓶 |
3瓶 |
2-8℃及以下 |
- 規格：100 Reactions。
- 有效期: 規定儲存條件下 12 個月。
- 已測試機型：
?PRISM? 7500 Real-Time PCR System (ABI)
?CFX96 (Bio-Rad)
?LineGene 9600 (博日)
?Roche 480 Lightcycler
?1.5ml 無菌低吸附離心管
?1000μl，100μl，10μl 無菌低吸附帶濾芯槍頭
?相關設備
?熒光定量 PCR 儀
?1000μl，100μl，10μl 移液槍
?操作過程
將試劑盒中提供的CHO DNA凍干定量參考品15ng,使用 0.5ml 復溶液溶解 。之后按照如下步驟依次稀釋至濃度為 30ng/ml、3ng/ml、0.3ng/ml、0.03ng/ml、0.003ng/ml(3fg/ul)。
具體操作如下：
- 向試劑盒中提供的CHO DNA 凍干定量參考品中加入 0.5mL DNA復溶液，蓋好膠塞，輕微振蕩混勻，此樣品為ST1。
- 取 5 支干凈的 1.5ml 離心管，分別標記為 ST0，ST2，ST3，ST4，ST5。
- 每管分別加入 90μl DNA 復溶液。
- 取 10μl 的 CHO DNA 定量參考品 ST1，加入 ST2 管，瞬時振蕩混勻后短時間快速離心 5s，重復 3 次以確保定量參考品與 DNA復溶液充分混勻。
- 按表 1 依次進行稀釋操作，稀釋步驟同 4。
表 1. CHO DNA 定量參考品的稀釋
| 稀釋管 |
稀釋體積 |
濃度(ng/ml) |
| ST1 |
1瓶CHO DNA 定量參考品+500μl DNA復溶液 |
30 |
| ST2 |
10μl ST1+90μl DNA復溶液 |
3 |
| ST3 |
10μl ST2+90μl DNA復溶液 |
0.3 |
| ST4 |
10μl ST3+90μl DNA復溶液 |
0.03 |
| ST5 |
10μl ST4+90μl DNA復溶液 |
0.003 |
| ST0 |
90μl DNA 復溶液 |
0 |
已融化未使用的 DNA 復溶液可保存于 2-8℃及以下。
根據需要設置 ERC 中的 CHO DNA 加樣濃度（以制備加 0.03ng/ml CHO DNA 量的樣本 ERC 為例），具體操作如下：
- 取 100μl 待測樣本加入 1.5ml 干凈的離心管中。
- 再加入 10μl ST3，混勻，標記為樣本 ERC。
樣本 ERC 和同批待測樣本一起進行樣本前處理，制備成樣本 ERC 純化液。
根據實驗設置陰性質控，具體操作如下：
- 取100μl 樣本基質溶液(或DNA 復溶液)加入 1.5ml 干凈的離心管中標記為陰性質控 NCS。
陰性質控 NCS 和同批待測樣本一起進行樣本前處理，制備成陰性質控 NCS 純化液。
- 根據所要檢測的標準曲線及待測樣本數量，計算所需反應孔數，一般做 3 個重復孔/樣。
- 反應孔數=（5 個濃度梯度的標準曲線+ 1 個無模板對照 NTC+ 1 個陰性質控 NCS +待測樣本×2）×3
待測樣本×2 是因為我們推薦每個待測樣本檢測時都應同時做樣本ERC。
- 從試劑盒內取出CHO 熒光定量PCR試劑一管，化凍至完全融化，置于冰上。
- 按表 2 所示加樣：
表 2.各反應孔加樣示例
| 標準曲線 |
20μl CHO 熒光定量PCR試劑 + 5μl ST1/ST2/ST3/ST4/ ST5 |
| NTC |
20μl CHO 熒光定量PCR試劑 + 5μl DNA 復溶液 |
| NCS |
20μl CHO 熒光定量PCR試劑 + 5μl NCS 純化液 |
| 待測樣本 |
20μl CHO 熒光定量PCR試劑 + 5μl 待測樣本純化液 |
| 樣本 ERC |
20μl CHO 熒光定量PCR試劑 + 5μl 樣本 ERC 純化液 |
加樣完成后每孔總體積為 25μl，本凍干試劑含有ROX染料。
表 3. 96 孔板排版示例
| NTC |
|
S1 |
S1 |
S1 |
S1 ERC |
S1 ERC |
S1 ERC |
|
|
|
|
A |
| NTC |
|
S2 |
S2 |
S2 |
S2 ERC |
S2 ERC |
S2 ERC |
|
ST5 |
ST5 |
ST5 |
B |
| TC |
|
S3 |
S3 |
S3 |
S3 ERC |
S3 ERC |
S3 ERC |
|
ST4 |
ST4 |
ST4 |
C |
| |
|
S4 |
S4 |
S4 |
S4
ERC |
S4
ERC |
S4
ERC |
|
ST3 |
ST3 |
ST3 |
D |
| NCS |
|
S5 |
S5 |
S5 |
S5 ERC |
S5 ERC |
S5 ERC |
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ST2 |
ST2 |
ST2 |
E |
| NCS |
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|
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ST1 |
ST1 |
ST1 |
F |
| NCS |
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|
|
|
|
|
|
|
|
G |
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|
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|
|
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|
|
|
|
|
H |
| 1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
|
表3為孔板排布示例圖，該示例表示的是檢測5 個濃度梯度的CHO DNA 標準曲線
（ST1～ST5）、1 個無模板對照 NTC、1 個陰性質控 NCS、5 個待測樣本（S1～S5）和每個樣本的 ERC（S1 ERC～S5 ERC）。每個檢測做 3 個重復孔。實際檢測時可根據樣本多少，參照此示例進行 96 孔板排版加樣。
5. 將 96 孔板用光學膜封閉，輕微震蕩混勻，短時間快速離心 10s 后放入 qPCR 儀。
以 AB 公司 7500 qPCR 儀、軟件版本 2.3 為例。
- 創建空白新程序，選擇絕對定量檢測模板。
- 創建新檢測探針，命名為 CHO-DNA，選擇報告熒光基團為FAM，猝滅熒光基團為 none，檢測參比熒光為 ROX。
- 設置兩步法反應程序：95℃預變性 10min；95℃ 30 s，60℃ 1 min，40 個循環；反應體積 25μl 。
以 AB 公司 7500 qPCR 儀、軟件版本 2.3 為例。
- 在 Results 的 Amplification Plot 面板中，將 Threshold 設置為 0.02，點擊 Analyze，此時可初步查看擴增曲線的形態是否正常。
- 在 Results 的 Plate 面板中，將標準曲線孔的 Task 一欄設置為Standard，并且在 Quantity 一欄分別賦值為30ng/ml、3ng/ml、0.3ng/ml、0.03ng/ml、0.003ng/ml，并且在相應的 Sample Name 一欄中命名為 ST1、ST2、ST3、ST4、ST5。
- 在 Results 的 Plate 面板中，將無模板對照 NTC 孔的 Task 一欄設置為 NTC，將陰性質控 NCS 孔、待測樣本孔、樣本 ERC 孔的Task 一欄設置為 Unknown，并且在相應的 Sample Name 一欄中命名為 NTC、NCS、S、ERC，之后點擊 。
- 在 Results 的 Standard Curve 面板中，可讀取標準曲線的斜率（Slope）、截距（Intercept）、R2。
- 在 Results 的 Report 面板中，Mean Quantity 一欄可讀取無模板對照NTC、陰性質控 NCS、待測樣本、樣本 ERC 的檢測值，單位為ng/ml。后續可在檢測報告中將單位換算為 pg/μl 或pg/ml。
結果分析的參數設置需依據具體的機型及使用的軟件版 本，一般也可由儀器自動判讀。
根據待測樣本和樣本 ERC 的檢測結果計算加樣回收率， 加樣回收率要求在 50%～150%之間。
陰性質控 NCS 的 Ct 值應大于標曲最低濃度 Ct 均值。
無模板對照 NTC 的檢測結果應為 Undetermined 或 Ct 值≥35。
